睾 丸 活检是 鉴别眷鲠栲孕梗阻性 与非梗阻性 无 精 子 症的可靠方法 ,但 其会对睾 丸造成不同程度 损伤。精 液 细胞DN A倍体分析可用来辅助 检测 生精 晟逋鲱蝎缺陷,是一种快速敏感、客观的精 液质量 检测方法。精 液 细 胞学检查可以诊断睾 丸生 精 障碍,是判断睾 丸生精 功能 的有 效方法。两种方 法均具有操作简 便,对患者无 创伤性的特点。本研究通过比较 梗 阻和非梗 阻无 精子症 患者精液 细胞D NA倍体分 析与细 胞学 检 查结果的特点,以期建立一 种无创的诊疗方案以 鉴别梗阻性 与非 梗阻性无精 子症。方法:自20 11年10月至2012年5月临 床选择非梗阻无 精 子 症20例,龄23~49(30.7±6.7)岁;梗阻 性 无 精 子症患 者8例,年龄 25~42(30.0±5.2)岁。按照WHO5方法进行精液分析证实为无 精 子症。精 液液 化后离 心取沉淀物,1份采用70%冰乙醇重 悬精液 沉 淀,4℃固定后 用P I染 色,采用流式 细 胞仪进行 DNA倍体分析。同 时,取精液 沉淀涂片 ,分别进行Diff-.Quic k染 色 和免 疫 组 织 化学染 色,以检测精 液 细 胞中 精原细 胞 和精 母 细 胞。
1.1 一般资料
实女方至少有一条 输卵 管通畅及无排卵 功 能障碍,并排除盆 腔炎 症和女性 生 殖内分泌异常 等潜在的不 孕因素的影响。我们将88个IUI周期根据 妊娠结局分成妊娠 组与非妊 娠组。
1.2 主 要 试 剂与仪 器
I S A S精 子分析系 统(西班牙);NIKON E1000 荧光 显 微 镜(日本);NIKON E200 普 通光学 显 微 镜(日本)。主 要试剂:低 熔 点 琼 脂、二 硫 苏糖 醇(DTT)、联 苯 吲哚(DAPI),均购自 美 国 Si g m a 公司。
1.3 标本采集
受检 者 应 禁 欲3~7d,用 手 淫或 体外排精 法收集 精子,标明采集的时间,置37℃平板上液化后进行检测。
1.4 SCD 实验
根据文献[5,6],精液标本处理:精 液标 本用 磷酸 盐 缓 冲 液(pH 6.8)调至10×106/ml 1000 rpm10min , 弃精浆, 精 子沉 渣 用磷酸盐 缓冲 液(pH 6.8)调至1×106~10×106/ml,取0.3ml 处理 好的 液与0.7 ml 1% 低熔 点琼 脂凝胶混匀,37℃ 孵育;吸取50ul 上述 精子混合液滴在经过0.65 % 正常熔点琼脂预处理过的载玻片上,盖上 22mm×22mm 盖玻片4℃放置5min。精 子变 性及 裂解:小心去 除盖玻 片,室温(22℃ 左右)将标本载玻 片浸入0.08 mol /l 的盐酸( HCL)内变 性7min;然后浸 入精子裂解液内(pH 7.3)20mi ;再移入缓 冲液 中3min,脱水。将 标本载玻片依次放入70% 、90%和100% 的乙醇 中脱水。所 有操作过 程均要求载玻片(标本)处于水平状态。空气自然干燥后加 入4′,6 二脒 基 吲哚 (DAPI) 染色,荧光 显微 镜 下观察 结 果。
1.5 精 子 核 蛋白组 型检测
精 液液化并记数 ,洗涤调 整精子 密 度至40 ×106/ml,取 精 液1 ml,1000g离心3min,去上清液,重复3次,去 除精浆加入1ml粘合液,取5ul涂片,空气干燥,加固定液固定90s,冲洗玻片,脱 色、封 片。镜 检: 涂 片经苯胺蓝染色 后,显 微 镜 下高含赖 氨 酸的精子核呈蓝 色,颜色 分布基本均匀,一般在精子核后半部分着色较深,顶 体部分蓝色较 浅,大部分精子不显 色,显蓝色 的为阳性 ,不显 色的 为阴 性, 每个标 本计数200个精子。
