1、MTT检测法1. MTT的配制:MTT对菌和光十分敏感,配制过程中注意无菌环境及避光,使用超净台配制时,可以将超净台的灯光先关掉。最好现用现配,避光4℃保存两周内有效,也可配置芤晟踔肿成储存液,-20℃保存,避免反复冻融。MTT具有致癌性,在配制的过程中,应注意防护,避免药物直接触碰皮肤。2. 细胞接种密度的确定:选择适当的接种密度,若密度太大,细胞对药物敏感性降低;若密度过小,则差异性太小。细胞密度控制在103-104之间。3. 血清的影响:高浓度的血清会对细胞的光吸收值长生影响,故细胞培养使用的血清浓度应该控制在10%以下。4. 设置凋零空和空白组,保证实验结果的准确性。5. 使用96孔板接种培养时,合理分配96孔板的位置,四周的孔用PBS来填充,因为置于培养箱中培养时,边缘孔的水分蒸发会很快,药物易被浓缩,加入PBS可以从一定程度上保证实验孔的水分。6. 注意测试药物是否与MTT发生反应:某些具有氧化还原性质的药物,会与MTT发生反应,将MTT还原成为棕褐色沉淀,故如存在此类药物,应在加入MTT前,用PBS对细胞清洗。7. 终止培养,溶解结晶:去除上清时,切记勿将MTT结晶体吸走,操作慎重,以免影响吸光值。可使用平板离心机将96孔板进行离心,或将培养板倾斜放置,用枪头尖部慢慢小心将上清液去除。
2、CCK-8检测法1、 根据所培养细胞的种类和细胞数量来确定细胞培养时间。细胞培养1-4小时后,可先从培养箱中取出,目测或使用酶标仪观察染色程度,若染色不充分,再将细胞放入培养箱中继续培养。2、 保证培养箱和培养板中间孔的湿度。培养板中间孔的湿度可以使用PBS填充边缘孔的方法来解决。3、 添加CCK-8试剂时,速度要快,避免药剂在墙头上停留时间过长,对药物浓度产生影响。也可在加样前用培养基稀释CCK-8。
3、Edu检测法1、 加入含有Edu的培养基时,飚颇壶颟培养基的用量以没过细胞为适宜。2、 根据培养细胞种类不同,确定细胞生长周亏坚橘锝期,再进一步确定Edu培养基的培养时间,大多数细胞为2小时培育时间。3、 固定细胞前,使用PBS清洗未进入细胞DNA的Edu,一般清洗次数为1-2次,每次5分钟,也根据不同的细胞选择清洗强度,避免细胞流失,造成密度不同。4、 染色完成后,最好立即进行观察 。如若条件限制,请4℃避光保存,保存时间不宜过长,不超过3天。