1、首先，从LB固体平板上.挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml LB液体培养基中[ 含利福平(30 mg L)、卡那霉素(70mg/L)和四环素(6.5mg/L) ]于恒温揭床上,27C，以180 r/min 的转速振荡培养过夜，至AOC为0.6~0.8。
2、然后，摇培过夜的菌液按1%~2%的比例，转人新配置的无抗生素的LB培养基中，在跤耧锿葡与上述相同的条件下培养6 h左右A00=0.2~0.5时即可用于转化。或将按上述方法培养的Aoo=0.6~0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，以5000 I/ min 的转速，离心10 min，弃去上清液，菌体用1/2 MS 液体(pH5.4~5.8)培养基重悬，稀释至A300=0.2 左右，用于转化。
3、然后侵染，于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具Kan 抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5 cm2的小块，放人菌液中,浸泡5~10min。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。
4、然后进行共培养，将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS 基本培养基(T1)上，用封口膜封好培养皿,28C黑暗中培养2~~4 d。
5、然后，进行选择培养，将黑暗中共培养2~4 d的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中,用封口膜封好培养皿，在光照为2 000~10 000 lx.25~28'C.16/8 h(day/荏鱿胫协night) 光暗条件下选择培养， a 盘边缘轻压人培养基中，以增加选择压力。
6、最后，进行生根培养，约2~3 周后，待不定芽长到1cm 左右时，切下不定芽并转移到生根培养基，上进行生根培养，5~10 d后长出不定根后即可转移到土中培养。
