1、引物自身及引物之间不应存在互补序列。连续互补的碱基应该要少于4 个。引物应使其△G 值不要太高，△G 值越大，则双链越稳定。
2、引物长度和GC 含量要适中。引物长度大概为18~28 bp，但不应大于38 bp，引物过短会影响到扩增的特异性，太长的话其延伸温度将会大于74 ℃，不利Taq 酶的催化反应。若扩增产物为4~5 kb，引物最好不要少于24bp；如果目的产物≤500 bp，引物长度只要16~18 bp 即可。上下游引物间的Tm 值的差值最好在10 ℃以内，GC 含量最好是40%~60%。
3、3′端不应该存在相似性高的序列，否则容易导致错配。3′端不能有多于3 个连续的G 或C，要不然引物错配会在GC 富集区。
4、引物3′端不能修饰，5′端可以修饰，还尽量要避开密码子第3 位。同时要注意选择3′端△G 值相对较低，5′端和中间△G 值较高的引物。
