1、如何看wb跑得好不好呢？下面就跟小编一起来看一看具体的操作吧。
2、 首先是缓冲系统：裂解液pH过高或过低都可能使蛋白质变性析出或水解，因此通常采用近似生理pH的buffer来作缓冲体系。Tris-HCl缓冲液因其缓冲能力强，不容易与其它离子形成不溶物，且与整个电泳系统兼容性好，因此是裂解的首选缓冲液。
3、 其次是盐离子浓度：通常大家习惯以生理盐浓度作为裂解液的盐离子浓度。在提胞浆蛋白等易溶组分时，也有通过低盐而实现低渗，从而使细胞胀破以实现泥撼费瘠质膜分离的，这种情况下一般使用不超过50mM的NaCl。当盐离子浓度过高时，部分蛋白可能会因盐析而出现沉淀， 此外过高的离子浓度会导致泳道内局部电流过大，最终跑出笑脸状条带，即使有少数蛋白可能需要高盐提取的，或借助盐析除去干扰蛋白的，最终NaCl浓度一般也不高于500mM。
4、 然后是离液剂：常用的离液剂有两类，一类是以尿素或硫脲为代表的离液剂，另一类则是各种表面活性剂（俗称去垢剂）。 尿素和硫脲性质类似，其对蛋白质的助溶可能是通过与蛋白质之间形成大量氢键实现的，做过包涵体纯化的童鞋对8M尿素的助溶能力想必一定非常清楚。在做蛋白提取时一般可以用6-8M尿素或/和2M硫脲助溶，这个组合尤其在制备二维电泳的样本中被普遍使用。
5、 重要的蛋白酶抑制剂：组织或细胞内通常含有大量的蛋白酶，在提取过程中这些蛋白酶被释放出来，有可能消化目的蛋白，因此抑制住这些蛋白酶的活性对于防止目的蛋白的降解极有帮助。常见的蛋白酶抑制剂有：PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin，AEBSF-HCL，其中PMSF对多种不同活性中心的蛋白酶都有极好的抑制作用而且效率高，因此基本是必加的试剂。蛋白酶抑制剂具体加多少，需要看你提取的组织或者细胞的特性而言。我们实验室正常使用量是RIPA：PMSF=100:1。另外，做磷酸化蛋白的Western blot时，还需要加入磷酸酶抑制剂，避免磷酸化形式的蛋白发生去磷酸化。
