1、首先打开NCB诔罨租磊I，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcript variant 1, mRNA ”,没有1就用2、3，以此类推。因为是Q-PCR，所以要去掉内含子，因此用mRNA。
2、从上一个页面点击FASTA，可以看到mRNA的序列。
3、搜索“NCBI BLAST”并点击进入，可以看到如下界面，往下拉。
4、点击进入"Primer-BLAST"
5、从第二步的页面复制序列或者序列摒蛲照燔号，粘贴在第一个框里。修改产物长度，即“PCR product size”,一般为100-200之间最好。还要选择“Exon junction span”为“primer must span an exon-exon junction”,这是为了排除DNA污染。其它的参数都可以不改。
6、把网页往下拉到底，点击左下角的“Get Primers”，耐心等待几分钟，网页就会弹出设计好的引物。
7、最后一步就是选择引物了。要选择自我洧粽袄淖配对和互相配对度低，产物长度尽量小的等等。需要指出的是，要注意看引物对非目标基因的检测潜力，如果它对于目标基因相似基因扩出的产物长度与目标产物长度一样长，唁昼囫缍这个引物的非特异性就很强，不能要。
