1、一、试剂准备1.预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。2.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。3.加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶）。4.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。5.4℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。6.准备Protein A agarose，用PBS 清洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。7. 每1 ml总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。8. 4℃，14000 g离心1 5min，将上清转到一个新的离心管中，除去Protein A的珠子。
2、9． （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。10.用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度稍高（如10 μg/μl）。11.加入一定体积的兔抗到500 μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。12.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。13.加入100 μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。14.14000 rpm瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。15.用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）。16.将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min变性。
3、二、免疫共沉淀反应1．转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min,细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；2． 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；3． 取10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3 000 rpm离心3 min；4.． 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4 h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；5． 免疫沉淀反应之后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心的吸去，琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；6． SDS-PAGE，Western blotting或质谱仪分析。
4、三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 ；3．收集上清（约30 ml）并加入30 μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；4．加0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；5．先用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，然后再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；
5、6．吸取出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min；7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜；8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1 ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
