1、客观认识紫外检测器与HPLC组合的局限性在杂质的检测和控制中，HPLC-UV组合曾经发挥了重要的作用，在杂质研究中普遍采用，但随着研究的不断深入，该方法的局限性逐步显现，其致命弱点就是得到的色谱图不一定能真实反映实际情况，有时出现杂质漏检。原因是：1）极性比目标物大得多的化合物可能与溶剂峰重叠而被掩盖；极性比目标物小得多的化合物则难以被洗脱，甚至滞留在色谱柱上。2）通常只用一个检测波长，无紫外吸收或在检测波长处吸收较差的化合物不能被有效检出。
2、充分重视梯度洗脱法的重要作用药物杂质的情况通常比较复杂，既有工艺和原料引入的杂质和中间体，也可能包含各种因素的降解物、副产物等共存物质，通常都是未知物，其极性、油/水分配特性有时相差较大。等度洗脱法难以在较短时间完全洗脱所有杂质；梯度洗脱则往往可以通过调节不同分析时间流动相组成，在较短时间内有效检出极性相差悬殊的系列物质，同时，还可以改善峰形、提高检测灵敏度、取得良好效果。图1是某产品中几种杂质对照品混合溶液等度洗脱和梯度洗脱的效果对比。因此，梯度洗脱法在国外的杂质研究中广为应用，呈现出逐步取代等度洗脱的趋势。梯度洗脱法的另一重要作用为验证等度洗脱法的可行性。与等度洗脱法相比，梯度法操作复杂，并可引起色谱基线漂移，影响结果精密度。因此，如果等度洗脱可以有效检出所有相关杂质，可作为首选的检测方法，但在研究过程中最好采用适当的梯度洗脱法予以验证，明确拟定的等度洗脱法是否全面检出了产品中的杂质。
3、充分关注检测波长的针对性、色谱系统的适用性和巷佯袜瘫检测手段的互补性药物中杂质情况的复杂性凸显了检测波长选择的重要性。图2中的A图是某注射液稳定性考察中286 nm波长检测有关物质的色谱图，B图为同一样品改用230 nm波长检测的色谱图，显示此时主药已降解殆尽，原286 nm波长检测到的主峰并非主成分，说明失当的检测波长可误导杂质研究的结果，影响剂型合理性的评价和选择。事实上该主药并不适于制成注射液剂型。检测波长应兼顾待测物中各杂质的吸收情况而确定，或在特定波长下检测特定杂质，而不能仅仅考虑主药的UV吸收特性。对于已知杂质，可选择各杂质均有较大吸收的波长；对于非特定杂质（未知杂质）可根据强制降解试验中DAD检测情况或比较几种不同检测波长处色谱峰的数量和大小等综合考虑确定检测波长。如产品包含无紫外吸收的杂质，可改用其他类型检测器，流动相许可时，蒸发光散射检测器的灵敏度高于示差折光检测器，已在无紫外吸收的氨基糖苷类抗生素组分及其杂质控制中得到较好应用。ECD检测器对于无紫外吸收的杂质控制在灵敏度方面更具优势，如阿奇霉素相关物质的控制在USP30中在原UV-HPLC方法基础上增加ECD-HPLC方法，并作为检测结果的仲裁方法。
4、一般来讲，原研厂对药物杂质经过了比较系统深入的研究，针对杂质的特点有时采用不常用的色谱填料或组成复杂的流动相系统，或方法的器皆阄诟分析时间较长，有时规定了最难分离物质对的分离度要求来确保有关杂质的有效检出，在仿制研究时，需要透彻理解原研厂分析方法的这些“缺憾”，谨慎思考新建方法的“优势”，规范进行方法改变前后分析结果的可比性研究。如图3为某药品有关物质在原研厂色谱柱与通用型C18柱上色谱峰对比，表明有时分析方法具备了普及性，却不能有效检出相关杂质。由于各种分析方法均具有一定的局限性，因此在进行杂质分析时，应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证，如HPLC与TLC的互相补充，反相HPLC系统与正相HPLC系统的相互补充，HPLC不同检测器的相互补充等。药物杂质的物质多样性决定了有时以现有技术难以使用单一检测手段同时检测所有杂质，如硝呋太尔的杂质检查就采用TLC法检测无紫外吸收且极性过大的杂质3-氨基-5（甲硫基）甲基-2-唑烷酮硫酸盐，用HPLC法检测其他杂质。
