1、我们咸犴孜稍先用最通俗易懂的语言来解释一下克隆：1+1=1。 1段目标序列插入1段质粒载体，获得1个目标质粒。怎样把目标序列插入到载体里呢？最经典的方法即是利用限制性内切酶法。常见做法包括：单酶切法和双酶切法。最重要的一点：不论单酶切还是双酶切，插入片段（非末端）不能含有拟选用限制性内切酶位点（序列）。
2、第一步：根据克隆目的选择酶切方法（单/双）。①如果只涉及（DNA向RNA）转录，不涉及（R鲍伊酷雪NA向蛋白质）翻译。即可不考虑插入序列方向，单酶切或双酶切均可。反之聩谳饨脍②，如须考虑插入序列方向性，建议优先选择双酶切法（如果选择单酶切法，筛选引物须注意方向）。
3、第二步：如果是双酶切，考虑插入末端类型。从成功率来说，粘性末端>平末端。所以优先粘性末端法连接或混合型。
4、第三步：考虑双酶切一步法还是两步法。一步法的前提是两种限制性内切酶可在相同buffer中反应。当然，双酶切（平末端）法中同样可能面临插入方向问题。建议优先选择双粘性末端或混合型。
5、第四步：如果不能避免（可用酶切位点少/破坏原有内切酶位点），可平末端法连接，然后通过筛选引物结合酶切或测序验证。
6、第五步：最后单独介绍一下如何破坏载体上原有限制性内切酶位点。分两种情况①单纯破坏位点，然后载体自连；②破坏位点然后插入目的序列。
7、第六步：针对情况①，可在两次酶切后统一进行（如T4 DNA聚合酶）平端化反应。
8、第七步：情况②根据后续操作依然可分为两种情况。如平端法插入目的片段，即在两次酶切后进行平端化；如为混合法插入目的片段，即须在第一次酶切后进行平端化（切记此时顺序不可错）。
