1、模板的选择选择合适的模板无疑成功了一半。虽然同是一种病毒的HA基因，但是这些基因之间是有差异的，有些适合作为引物设计的模板，有些却不适合。我们可以找到3-5条最近期被GenbanK登录的，然后全部下载下来进行基因比对，最终找到一条较完整的序列。
2、软件的选择可以用来进行引物设计的软件有很多，比如Primer5.0，DNAStar中的PrimerSelect和NCBI中的相关板块都可以进行引物设计，小编经常使用Primer5.0。
3、开放阅读框ORF什么是ORF，通俗来讲就是基因可被翻译的部分。我们设计引物最好是在ORF内设计，当然非ORF设计的引物也是能被接受的。
4、产物片段大小对于鉴定引物来说，其产物片段较小，一般取400-600bp。产物片段大小要适中，太小易出杂带，太大敏感性下降。
5、选择保守区域设计一对颖腩衤趟鉴定引物，先要在病毒模板上选择合适的区域。什么才是适合的呢？首先要能对病毒进行分型，以跽啻猢崇流感病毒HA基因为例，HA是流感病毒主要的表面抗原，对病毒分型至关重要。其次，选择基因相对保守的区域，也就是变化较少的区域，比如HA相对保守的区域在400bp以后，也就是最好选择400-1600bp的范围，这步至关重要。
6、引物Tm值Tm是影响引物质量的一个要素，过高过低都不好，一般50-60℃；并且这一对引物各自的Tm值之差最好在2℃以内。拿到引物之后我们还要对其最佳的退火温度Tm值进行摸索。
7、产物GC含量产物的GC含量多少对合成率也有影响，我们一般将产物的GC含量把控在40%-50%之间，且两条产物之间的差距不能太大。
8、产物合成率高判断引物设计好坏的一大关键就是产物的合成率，合成率高达100是最理想的，90以上还可以接受。引物与引物之间、引物与模板之间会出现四种错配的情况，这四种情况最好不要出现，若非有不可的话，数量越少越好。
